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哪些原因?qū)е翽CR檢測(cè)結(jié)果被污染?如果PCR檢測(cè)結(jié)果被污染怎么辦?

分類: 產(chǎn)品文章
發(fā)布時(shí)間: 2021-12-02 16:57:45
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什么是PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆法,它的鼎鼎大名在分子生物學(xué)領(lǐng)域可謂如雷貫耳,近年來(lái)無(wú)論是如日中天的精準(zhǔn)醫(yī)療,還是穩(wěn)步發(fā)展的基因診斷都離不開PCR技術(shù)這位“老母親”。PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛的問(wèn)題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

哪些原因?qū)е翽CR檢測(cè)結(jié)果被污染?

1、標(biāo)本間交叉污染:

標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

 

2、PCR試劑的污染:

主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

 

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:

這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問(wèn)題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/mL),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。

 

4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問(wèn)題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。

 

如何防止PCR檢測(cè)結(jié)果被污染?

1、合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。

最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

 

2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

 

3、預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機(jī)會(huì)。另外,PCR試劑,PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

 

4、防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

 

5、設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

 

6、減少PCR循環(huán)次數(shù),只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

 

7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入,打開離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。

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標(biāo)簽: PCR檢測(cè)
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